Forschende untersuchen unerwünschte Farbveränderungen in der ­Fluoreszenzmikroskopie – und finden Wege, Messfehler zu minimieren

Ein grüner Marker leuchtet plötzlich bläulich, ein Signal verblasst – und die Ergebnisse eines Experiments stehen infrage. Forschende vom Leibniz-IPHT und aus Ljubljana haben untersucht, warum Fluoreszenzfarbstoffe unter dem Mikroskop ihre Farbe verändern und wie sich Messfehler verhindern lassen. Ihre Erkenntnisse helfen, die Genauigkeit mikroskopischer Analysen in Biologie und Medizin zu verbessern.

Laserlicht ist ein zentrales Werkzeug der Fluoreszenzmikroskopie. Durch gezielte Anregung fluoreszierender Farbstoffe macht es biologische Strukturen sichtbar – von einzelnen Proteinen bis zu komplexen Zellnetzwerken. Doch genau diese Beleuchtung kann die Farbstoffe chemisch verändern – mit Folgen für die Bildgenauigkeit. Intensive Lichtbestrahlung kann ihre Struktur verändern, wodurch ihr Signal verblasst oder sich im Farbspektrum verschiebt.

Diese lichtinduzierten Veränderungen sind als Photobleaching (Ausbleichen) und Photoconversion (lichtinduzierte chemische Umwandlung) bekannt. Besonders problematisch ist Photoblueing – eine Farbverschiebung hin zu kürzeren Wellenlängen.

„Wenn das passiert, kann das dazu führen, dass ein Signal in einem anderen Kanal erscheint oder völlig verschwindet – und damit die Ergebnisse verfälscht werden“, erklärt Prof. Dr. Christian Eggeling. Der Experte für Super-Resolution-Mikroskopie leitet am Leibniz-IPHT die Forschungsabteilung Biophysikalische Bildgebung. 2024 erhielt er einen Ruf an ein Forschungsinstitut in Oxford, Großbritannien, den die Friedrich-Schiller-Universität Jena erfolgreich abwehren konnte.

Wie sich Farbverschiebungen ­vermeiden lassen

Ein Team um Christian Eggeling vom Leibniz-IPHT und der Universität Ljubljana am Jožef Stefan Institute hat diese Prozesse nun systematisch untersucht. Die Forschenden testeten verschiedene Fluoreszenzmarker und analysierten, unter welchen Bedingungen es zu Farbverschiebungen kommt. Ihr Fazit: Während herkömmliche Mikroskopieverfahren wie konfokale Mikroskopie oder STED-Mikroskopie relativ robust gegenüber diesen Effekten sind, können Farbveränderungen in bestimmten Anwendungen erhebliche Messfehler verursachen – etwa bei Verfahren, die die chemische Umgebung von Molekülen analysieren.

Eine zentrale Erkenntnis ihrer in ­Nature Methods veröffentlichten Studie: Es gibt Farbstoffe, die besonders anfällig für Photoblueing sind – und andere, die deutlich stabiler bleiben. „Die Wahl des richtigen Markers kann den Unterschied machen“, betont Agnes Koerfer, die gemeinsam mit Anindita Dasgupta maßgeblich an der Untersuchung beteiligt war. „Wir konnten zeigen, dass einige Fluoreszenzfarbstoffe die Effekte minimieren und so zu zuverlässigeren Messergebnissen führen.“

Zusätzlich fanden die Forschenden heraus, dass eine geschickte Anpassung der Belichtungsbedingungen helfen kann. So lässt sich durch eine reduzierte Beleuchtungsstärke oder den Einsatz von Farbstoffen mit einem austauschbaren Markierungsmechanismus das Risiko von Farbverschiebungen verringern.

Verlässliche Farben für Zellbiologie und ­Infektionsforschung

Die neuen Erkenntnisse verbessern die Präzision mikroskopischer Analysen und haben potenzielle Auswirkungen auf viele Forschungsfelder. Sie helfen nicht nur dabei, bestehende Mikroskopietechniken zu optimieren, sondern auch bei der Analyse biologischer Prozesse – etwa in der Zellbiologie oder der Infektionsforschung.

„Wenn wir beispielsweise untersuchen, wie sich Viruspartikel in einer Zelle bewegen, müssen wir sicherstellen, dass unsere Markersysteme stabil sind“, erklärt Eggeling. „Unsere Studie zeigt, dass wir durch gezielte Wahl der Farbstoffe und der Beleuchtungsbedingungen genauere Ergebnisse erhalten können.“

Das ist besonders relevant für die medizinische Diagnostik und die Entwicklung neuer Therapien. „Viele biologische Prozesse lassen sich nur durch langfristige Beobachtung von Zellen verstehen“, ergänzt Koerfer. „Wenn die Signale dabei durch Farbveränderungen verfälscht werden, kann das die Interpretation von Experimenten erheblich erschweren.“

Auf dem Weg zu ­präziseren Methoden

Die Forschenden hoffen, dass ihre Ergebnisse dazu beitragen, Standardverfahren in der Fluoreszenzmikroskopie zu verbessern. Ihre Erkenntnisse könnten in Zukunft helfen, neue Farbstoffe zu entwickeln, die noch stabiler sind und so noch genauere ­Messungen ermöglichen.

„Die Mikroskopie entwickelt sich ständig weiter“, sagt Eggeling. „Unsere Aufgabe ist es, sicherzustellen, dass wir mit den besten Methoden arbeiten – damit wir die molekulare Welt so präzise wie möglich ­erfassen können.“

Original-Publikation: https://doi.org/10.1038/s41592-024-02297-4