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Oberflächen-verstärkte Raman-Streuung von Zelllysaten für eine verbesserte Tumorzelldetektion

Oberflächen-verstärkte Raman-Streuung (SERS) ist eine leistungsfähige Technik, die zur Zellidentifikation und -differenzierung verwendet werden kann. Ein SERS-Ansatz mit Silbernanopartikeln, der zuvor für den Nachweis von Bakterienzellen entwickelt wurde, wurde auf Tumorzelllysate übertragen. Eine Kombination aus SERS und Mikrofluidik erhöhte den Durchsatz und die Genauigkeit der Zelldiskriminierung.

Drei Arten von Leukämiezelllinien, THP-1, Jurkat und MONO-MAC-6, wurden in einen Tropfen-basierten Mikrofluidikchip injiziert. Mehrere Tausend Spektren wurden in dem Chip von den Tröpfchen gesammelt, die Zelllysate gemischt mit Silbernanoteilchen und KCl enthielten. Ein PCA-SVM-Modell unterschied die drei Leukämiezellentypen mit hoher Genauigkeit.

Von CHRISTOPH KRAFFT // MOHAMED HASSOUN // JÜRGEN POPP

Laut der weltweiten Krebsstatistik von 2012 wurden pro Jahr 14,1 Millionen neue Fälle und 8,2 Millionen krebsbedingte Todesfälle geschätzt. Bis zum Jahr 2030 wird mit einer Zunahme auf jährlich 23,6 Millionen Neuerkrankungen gerechnet. Die Bedeutung des Themas zeigt sich darin, dass statistisch gesehen jeder dritte Europäer im Laufe seines Lebens an Krebs erkranken wird. Es wurde gezeigt, dass Raman-Spektroskopie Krebsgewebe und -zellen ohne Markierung oder andere Präparation nachweisen kann. Die Intensitäten der Raman-Signale hängen jedoch vom schwachen Prozess der inelastischen Lichtstreuung ab. Die Oberflächen-verstärkte Raman-Streuung (SERS) mit Edelmetall-Nanopartikeln kann die Intensität der Raman-Banden um mehrere Größenordnungen erhöhen. Die verbesserten Raman-Signale ermöglichen den Nachweis von Analyten bei niedrigeren Konzentrationen, die Verringerung der Messzeit bzw. einen besseren Durchsatz. Die Erkennung von Tumorzellen durch Immun-SERS-Marker in einem mikrofluidischen Fluss bei 25 ms Messzeit wurde kürzlich gezeigt (1). Das Protokoll zur Herstellung von Immun-SERS-Markern war jedoch sehr komplex. Hier wurden Silbernanopartikel (Ag-NPs), die nach einem Protokoll von Leopold und Lendl in einem einstufigen Prozess leicht hergestellt werden können, zum Nachweis von Tumorzellen eingesetzt.

Unser Ansatz beginnt mit der Lyse von Zellen mit einer Ultraschallsonde. Das homogene Zelllysat trägt zu einer hohen Reproduzierbarkeit bei, da alle intrazellulären Biomoleküle in der Lage sind, mit Nanopartikeln zu interagieren. Da Ag-NPs Plasmonenresonanz im Bereich zwischen 400 und 500 nm zeigen, wurde Kaliumchlorid (KCl) hinzugefügt, um Aggregation zu induzieren und die Plasmonenresonanz für SERS mit 785 nm Laseranregung in Richtung 800 nm zu verschieben. Der Ansatz wurde erstmals in 96-Well-Plattenküvetten demonstriert, in denen Zellen von zwei Leberkrebszelllinien, HepG2 und SK-Hep1, einer Pankreaskrebszelllinie, Capan-1, und einer Brustkrebszelllinie, MCF7, mit Ag-NP und KCl gemischt wurden. Der Laser wurde auf die Oberfläche der Mischung fokussiert und SERS-Spektren wurden gesammelt. Die Experimente wurden unter Verwendung von sechs Chargen für jede Zelllinie wiederholt, um die Reproduzierbarkeit zu demonstrieren. Ausgeprägte spektrale Variationen wurden zwischen Zelllinien gefunden, während die Standardabweichung zwischen SERS-Spektren verschiedener Chargen klein war. Eine Support Vector Machine (SVM) wurde trainiert, um die vier Krebszelllinien mit Genauigkeiten über 96% zu klassifizieren. Weitere Einzelheiten sind in (2) aufgeführt.

Dann wurde dieser Ansatz auf einen mikrofluidischen Lab-on-a-Chip (LOC) übertragen, der aus Quarzwafern für die Kompatibilität mit der Laseranregung bei 785 nm hergestellt wurde. LOC-Experimente ermöglichen die genaue Erzeugung von Tröpfchen in einem Mineralölstrom, indem Nanoliter-Volumina Ag-NPs, KCl und Zelllysat gemischt werden. Reproduzierbare SERS-Spektren von Tausenden von Tröpfchen wurden an einer definierten Position des Chips mit 1 Sekunde Belichtungszeit gesammelt. Drei Chargen von drei Leukämiezelllinien, MONO-MAC-6, THP-1 und Jurkat, wurden hergestellt, durch Ultraschall lysiert und in den Chip injiziert. SERS-Spektren mit spektralen Beiträgen aus dem Trennmedium-Öl wurden vor der SVM-Klassifizierung aus dem Datensatz entfernt. Die Daten wurden in Trainingssatz, bestehend aus Spektren, die aus zwei Chargen von drei Zelllinien aufgezeichnet wurden, und Testsatz, bestehend aus Spektren, die von einer anderen Charge der drei Zelllinien aufgezeichnet wurden, aufgeteilt. Der Testsatz wurde dann nach dem SVM-Modell klassifiziert, das unter Verwendung des Trainingssatzes entwickelt wurde. Basierend auf Klassifikationsergebnissen wurden Genauigkeit, Sensitivität und Spezifität des SVM-Modells für die Identifizierung von THP-1, Jurkat und MONO-MAC-6 berechnet und in einer Konfusionsmatrix zusammengestellt. Alle Werte waren besser als 99%, was mit einer genaueren Vermischung, einer geringeren Standardabweichung und einer verbesserten Reproduzierbarkeit in (3) verglichen mit der vorherigen Veröffentlichung (2) übereinstimmt.

Nächste Arbeiten umfassen die Hinzunahme von Nicht-Tumor-Zellen als Kontrollen, die zelluläre Aufnahme von Ag-NPs für eine Einzelzellanalyse und den Nachweis des Anteils von Krebszellen in gemischten Populationen.

Gefördert von: DAAD

Zugehörige Publikationen

(1) I. Freitag, C. Beleites, S. Dochow, J. Clement, C. Krafft, J. Popp. Recognition of tumor cells by immune SERS markers in a microfluidic chip at continuous flow. The Analyst, (2016). 141: 5986-5989

(2) Hassoun M, Schie IW, Tolstik T, Stanca S, Krafft C, Popp J. Surface enhanced Raman spectroscopy of cell lysates mixed with silver nanoparticles for tumor classification. Beilstein J Nanotechnol, 8:1183–90 (2017).

(3) Hassoun M, Rüger J., Kirchberger-Tolstik, T, Schie, I. W, Henkel, T, Weber, K, Krafft, C, Popp, J. A droplet-based microfluidic chip as a platform for leukemia cell lysate identification using surface-enhanced Raman scattering. Analytical and bioanalytical chemistry. 410: 999-1006 (2018).

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