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Untersuchung des Carotinoid-Gehalts von Mikroalgen mittels kohärenter Anti-Stokes- und spontaner Raman-Mikroskopie

Abgestimmte Laserpulse für die CARS-Mikroskopie wurden verwendet, um die Pigmentverteilung in Kieselalgen abzubilden. Wir berichten über die relative Veränderung als Reaktion auf unterschiedliche Lichtzyklen mittels einer markerbasierten Wasserscheidenanalyse der aufgenommenen Bilder. Gleichzeitig wurden die zugrundeliegenden Veränderungen der spezifischen Pigmentzusammensetzung mittels Raman-Mikrospektroskopie bei 785 nm Anregungswellenlänge untersucht.

Von Christoph Krafft // Michael Schmitt // Jan Rüger // Fisseha-Bekele Legesse // Tobias Meyer // Jürgen Popp

Das Interesse an Anbau und Ernte von Mikroalgen wächst kontinuierlich, vor allem durch die Produktion von Biokraftstoffen. Parallel dazu gewann auch die Extraktion anderer wertvoller Nebenprodukte wie bspw. Carotinoide an Attraktivität, die in der Pharma-, Lebensmittel- und Kosmetikindustrie vielfältige Anwendungen gefunden haben. So weist beispielsweise das Xanthophyll Fucoxanthin (Fx) antioxidative, entzündungshemmende und krebshemmende Eigenschaften auf. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie sind gängige Analysemethoden zur Untersuchung des chemischen Gehalts von Mikroalgen, die jedoch eine aufwändige Probenvorbereitung und große Probenmengen erfordern. Raman-basierte Methoden hingegen bieten eine Analyse auf Einzelzell- oder gar subzellulärer Ebene, sind zerstörungsfrei und kommen ohne Probenvorbereitung aus. Mittels Raman-Mikrospektroskopie wurden die chemischen Fingerabdrücke von Lipiden und Pigmenten in Mikroalgen identifiziert, die Wachstumsphasen der Kieselalgen bewertet (1) und die Silica-Schale der Kieselalgen abgebildet (2). Die Nachteile der Raman-Spektroskopie in der Mikroalgenforschung sind die relativ kleinen Querschnitte von Biomolekülen und der autofluoreszierende Hintergrund von Chlorophyllpigmenten bei Laseranregung im sichtbaren Bereich. Diese Probleme führen zu relativ langen Aufnahmezeiten für die Raman-Bildgebung und erfordern mehrere Schritte bei der Verarbeitung der Bilder. Unsere jüngste Publikation löst diese Probleme durch den Einsatz der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) Mikroskopie (3).

Im CARS-Prozess werden hochenergetische Pikosekundenimpulse der Pumpenfrequenz νpund der Stokes-Frequenz νsso abgestimmt, dass sie die Raman-aktiven Schwingungen bei ihrer Differenzfrequenz (νp- νs) kohärent anregen. Die unelastische Streuung eines dritten Pulses der Probefrequenz νpaus dieser Vibration führt zu einem Anti-Stokes-Signal bei der Frequenz νas= 2νp- νs. Die CARS-Mikroskopie ermöglicht die Aufnahme von Bildern mit Videobildraten per Laser-Scanning-Mikroskopen und vermeidet das Problem der Ein-Photonen-Fluoreszenz, da das Anti-Stokes-Signal von den Anregungspulsen ins Blaue verschoben wird. Ein weiterer Vorteil richtig gewählter Laserpulsfrequenzen besteht darin, dass Bilder von Zwei-Photonen-angeregter Fluoreszenz (TPEF) gleichzeitig registriert werden können. Frühere CARS-Studien über Algen haben sich auf die Untersuchung des Lipidstoffwechsels konzentriert, da Lipide aufgrund der reichlich vorhandenen CH2-Streckschwingungen intensive Signale liefern.

Bei der (3) CARS-Mikroskopie wurden TPEF-Mikroskopie und Raman-Spektroskopie eingesetzt, um den Einfluss verschiedener Lichtzyklen auf die Pigmentakkumulation in zwei Kieselalgen zu untersuchen. CARS-Bilder konzentrierten sich auf das markante Carotinoid- und Fx-Band bei 1528 cm-1und seine morphologische Veränderung bei unterschiedlichen Bedingungen. TPEF sondiert hauptsächlich Chlorophyll in Chloroplasten und seine Anordnung in Bezug auf die Struktur der Zelle. Das Sichtfeld unter Verwendung einer 25×, 1,1 NA-Wasserimmersionsobjektivlinse betrug 200×200 µm2bei 1024×1024 Pixel Auflösung. Die Verweildauer von 2 µs pro Pixel summiert sich zu einer Gesamtaufnahmezeit von 8 s. 10 Raman-Spektren mit einer Belichtungszeit von je 0,5 s wurden entlang einer Linie innerhalb von Kieselalgen bei 785 nm Anregungswellenlänge mit einer 60×, 1,0 NA-Objektivlinse gesammelt. Es wurden Unterschiede in den molekularen Fingerabdrücken der Zellen identifiziert, die mit den Variationen der Lichtzyklen korrelieren (hell:dunkel 20:4 h, 12:12 h und 4:20 h).

Abbildung 1 zeigt multimodale Bilder der Kieselalgen Ditylum brightwellii und Stephanopyxis turris. Der rote Kanal repräsentiert die CARS-Modalität, während die TPEF-Modalität im grünen Kanal mitangezeigt wird. Da sich Multiphotonen-Effekte auf ein kleines konfokales Volumen beschränken, wurden Tiefenprofile aus Bildern in axialen Schritten von 1 µm erstellt. Carotinoide wurden in den Chloroplasten der Kieselalgen lokalisiert. Die Chloroplasten, die die Carotinoide in S. turris enthalten, sind um den Randbereich herum angeordnet, so dass die Grenzen der Zelle bereits durch die beiden Modalitäten markiert sind. Die Bildanalyse ergab, dass Zellen, die unter längeren Dunkelzyklen (4:20) gehalten wurden, Chloroplasten enthielten, die eine relativ stärkere CARS-Signalintensität aufwiesen und größer waren als jene, die unter (20:4) Zyklen gehalten wurden. Dies bedeutet, dass die Verlängerung des Dunkelzyklus zu einer Akkumulation von mehr Pigmenten führt.

Abbildung 2 zeigt ein durchschnittliches Raman-Spektrum aller untersuchten Kieselalgenzellen mit Markierungen markanter Bänder von Chlorophyll a bei 746, 988 und 1328 und von Carotinoidarten bei 1162 und 1528 cm-1. In einem 100-fach wiederholten Vorgang wurden PLS-LDA-Klassifikationsmodelle mit zufälligen Teilproben der Hälfte des Datensatzes (180 Spektren) trainiert, während die übrigen 180 Spektren zur Validierung verwendet wurden. Der Score-Plot eines zufällig ausgewählten Iterationsschrittes visualisiert die Klassifikationsleistung. Zwei unabhängige Score-Layer werden kombiniert. Im ersten Layer stellen farbige Hexagone ein zweidimensionales Histogramm der Trainingsdaten im linearen Diskriminanz-Subraum dar. Im zweiten Layer zeigt ein Streudiagramm mit Kreisen, Quadraten und Dreiecken die jeweiligen Modellprojektionen des Testdatensatzes. Alle vorhergesagten Objekte sind korrekt ihrer jeweiligen Klasse zugeordnet. Die Interpretation der Modellkoeffizienten (nicht dargestellt) deutet darauf hin, dass ein Kontrollmechanismus zu einer relativen Veränderung im Carotinoidpool führt. Das Verhältnis der lichtschützenden Pigmente Diadinoxanthin und Diatoxanthin Ddx/Dtx relativ zum Zusatzpigment steigt bei höheren Lichtverhältnissen.

Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass CARS, TPEF und spontane Raman-Mikroskopie komplementäre Techniken sind, um den Einfluss metabolischer Faktoren auf die Pigmentakkumulation bei Kieselalgen zu untersuchen.

Gefördert von: DFG

Zugehörige Publikationen: 

(1) J. Rüger, N. Unger, I.W. Schie, E. Brunner, J. Popp. Assessment of growth phases of the diatom ditylum brightwellii by FT-IR and Raman spectroscopy. Algal Research (2016) 19, 246-252.

(2) M. Kammer, R. Hedrich, H. Ehrlich, J. Popp, E. Brunne, C. Krafft. Spatially resolved determination of the structure and composition of diatom cell walls by Raman and FTIR imaging. Anal. Bioanal. Chem. (2010) 398, 509-517.

(3) F.B. Legesse, J. Rüger, T. Meyer, C. Krafft, M. Schmitt, J. Popp. Investigation of microalgal carotenoid content using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy and spontaneous Raman Spectroscopy. ChemPhysChem (2018) 19(9) 1048-1055.

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