EN
Logo Leibniz IPHT
EN
Logo Leibniz IPHT

Identifizierung von exazerbationsrelevanten Pilzsporen bei chronischen Atemwegserkrankungen mittels UV-Raman-Spektroskopie

Eine Exposition gegenüber bestimmten Arten von Pilzsporen kann zur Entwicklung oder Verschlimmerung bereits bestehender Atemwegserkrankungen führen. Deshalb ist es sehr wichtig, gefährliche Arten in der Luft zu identifizieren. UV-Raman-Spektroskopie, die spektrale Fingerabdrücke von Mikroorganismen erstellen kann, hat das Potenzial, Pilzsporen der richtigen Gattung und Art bzw. sogar dem richtigen Stamm zuzuordnen.

Abb. 1. Score-Plots der linearen Diskriminanzanalyse für das Klassifikationsmodell auf Gattungsebene.

Von O. Žukovskaja // K. Weber 

Pilzsporen sind einer von mehreren Umweltfaktoren, die für die Entstehung von Atemwegserkrankungen wie Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen oder Aspergillose verantwortlich sind bzw. für das Auslösen von Exazerbationen bei chronischen Formen von Krankheiten. Krankheit und Schwere der Exazerbation hängen jedoch von den Pilzsporen-Taxa und der Anfälligkeit der Person ab. Daher sollte die Zusammensetzung der Pilzsporen in der Luft bestimmt werden, sodass empfindliche Individuen Präventivmaßnahmen ergreifen können, um die Exposition gegenüber pathogenen Pilzarten zu vermeiden. Der „Goldstandard“ für die Pilzidentifizierung basiert derzeit auf der Kultivierung von Probenorganismen. Diese aufwändige Methode ist jedoch zeitintensiv und erfordert gut ausgebildetes Personal.

Die Raman-Spektroskopie bietet sich hier als Alternative für diese Aufgabe an, da sie Informationen über die Molekularstruktur und chemische Zusammensetzung der Proben liefert. Verschiedene Mikroorganismen variieren beispielsweise in der Zusammensetzung des Proteoms oder der Zellwand und weisen daher leicht unterschiedliche Raman-Spektren auf. Mit chemometrischen Ansätzen ist es möglich, selbst kleine Unterschiede zwischen den Proben zu erfassen und Mikroorganismen auf verschiedenen taxonomischen Ebenen zu unterscheiden. Für einige pigmentierte Arten kann dies jedoch schwierig sein, da sich der hohe Fluoreszenzhintergrund mit dem Raman-Signal überschneidet. Deshalb wurde der Einsatz von UV-Raman-Spektroskopie bei einer Anregungswellenlänge von 244 nm zur Identifizierung von Pilzsporen untersucht, da so eine energetische Trennung von Fluoreszenz und Raman-Signal möglich ist.

Drei Chargen von acht verschiedenen hochpigmentierten Pilzarten (Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus calidoustus, Cladosporium herbarum, Alternaria alternata, Penicillium rubens und Lichtheimia corymbifera), die weltweit in unterschiedlichem Maße an Atemwegserkrankungen beteiligt sind, wurden mittels UV-Raman-Spektroskopie vermessen. Raman-Spektren aller Pilzsporenarten weisen Primärbanden im Fingerabdruckbereich auf, welche bei der UV-Raman-Spektroskopie typischerweise mit verschiedenen Nukleinsäuren und Protein-Untereinheiten assoziiert sind. Die spektrale Position der Bänder war für alle untersuchten Arten gleich. Die Intensitäten waren jedoch unterschiedlich, was auf unterschiedliche Zusammensetzungen der Sporen hinweist. Die gesammelten Spektren wurden für die anschließende statistische Analyse verwendet. Es wurden Klassifizierungsmodelle mittels Hauptkomponentenanalyse und linearer Diskriminanzanalyse erstellt und per Leave-one-batch-out-Kreuzvalidierung validiert.

Zunächst wurde das Klassifikationsmodell erstellt, um Sporen auf Gattungsebene zu unterscheiden. Die erzielten Ergebnisse zeigten mit 97,5 % nicht nur eine hohe Genauigkeit bei der Klassifizierung, sondern spiegelten auch die phylogenetische Beziehung zwischen den verschiedenen Gattungen wider. A. alternata und C. herbarium, die zur gleichen Klasse der Dothideomycetes gehören, wurden gut getrennt von den Sporen von Penicillium und Aspergillus, die der Klasse der Eurotiomycetes zugeordnet sind, und L. corymbifera, die zu einer niedrigeren Gruppe von Pilzen gehören, dem Stamm Zygomycota (Abbildung 1). Im zweiten Schritt wurde die Möglichkeit der Unterscheidung zwischen vier verschiedenen Aspergillus-Arten untersucht. Das erstellte Modell wies alle Spektren korrekt zu, was einer Genauigkeit von 100% entsprach. Schließlich wurde das Modell trainiert, um drei verschiedene Stämme von A. fumigatus zu klassifizieren, da hier Unterschiede in der Virulenz dokumentiert sind. Die Klassifizierung war für 89,4% der Spektren korrekt.

Zugehörige Publikationen

Olga Žukovskaja, Sandra Kloß, Matthew G. Blango, Oleg Ryabchykov, Olaf Kniemeyer, Axel A. Brakhage, Thomas W. Bocklitz, Dana Cialla-May, Karina Weber, and Jürgen Popp; Analytical Chemistry 2018 90 (15), 8912-8918

DOI: 10.1021/acs.analchem.8b01038

Logo Leibniz-Gemeinschaft