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Arbeitsgruppe Biomedizinische Bildgebung

 Fluoreszenzmikroskopie mit höchster Auflösung

Die Entwicklung hochauflösender Bildgebungsverfahren auf Basis der Fluoreszenzmikroskopie ist ein hochaktuelles Forschungsgebiet (Nobelpreises für Chemie 2014). Die Forschungsabteilung Mikroskopie konzentriert sich auf Weiterentwicklungen zu höchster lateraler Auflösung, dreidimensionaler Bildgebung sowie konfokaler Laserscanningmikroskopie.

Hohe laterale Auflösung (SIM, dSTORM):

Bei der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) führt die Beleuchtung der Probe durch ein Streifenmuster zu einer Verschiebung schnell variierender Muster in das Raumfrequenzübertragungsband des Objektivs und damit zur Auflösungsüberhöhung. Die Forschungsarbeit zu SIM konzentriert sich auf:

  • Mehrfarb SIM mit bis zu drei Anregungskanälen
  • Schnelles SIM mit Bildaufnahmeraten bis zu 700 Bildern pro Sekunde
  • Multifokales SIM zur gleichzeitigen Messung mehrere Fokalebenen
  • Nichtlineares SIM zur weiteren Steigerung der Auflösung
  • Polarisationskodiertes SIM zur Verbesserung der Tiefenaulösung
  • Multiphotonen SIM um höchste Auflösungen auch tief in stark streuendem Gewebe zu erreichen

Eine zweite Möglichkeit zur lateralen Auflösungserhöhung bietet dirkete Stochastisch-optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM). Bei der dSTORM Technik werden Einzelbilder aufgenommen, bei denen statistisch nur wenige Fluorophore angeregt worden. Deren Position kann sehr genau bestimmt werden. Das hochaufgelöste Bild wird dabei aus einer Überlagerung vieler solcher Einzelbilder zusammengesetzt.

Ziel der Forschungsaktivitäten ist u.a. die Kombination dieser Methode mit automatisierten multiplen Färbe- und Bildaufnahmeschritten für die Entwicklung eines systematisch arbeitenden hochaufgelösten Analysetool.

Dreidimensionale Bildgebung

  • Lichtschichtmikroskopie: Ermöglicht die mikroskopische Analyse verhältnismäßig großer Volumina auch in stark streuenden Medien. Zukünftig soll das aktuell existierende Mikroskop zu klinischen Anwendungen hin weiterentwickelt werden.
  • Holoskopie: Holoskopische Methoden ermöglichen das sehr schnelle Aufnehmen  dreidimensionaler Probeninformationen.

Laserscanningmikroskopie

Dritte Säule der Fluoreszenzmikroskopie bildet die konfokale Laserscanningmikroskopie (LSM). Hierbei werden zwei Ansätze zur Auflösungsüberhöhung üblicher Konfokaltechniken verfolgt:

  • Optical Photon ReAssignment Microscopy
  • Bildinversionsinterferometrie (UZI)

 Alternative mikroskopische Verfahren

Bei der Entwicklung alternativer mikroskopischer Methoden verfolgen wir verschiedene Ansätze. Durch ihre Mannigfaltigkeit ergänzen sie einerseits die bekannten Methoden der Fluoreszenzmikroskopie. Andererseits bieten sie die Möglichkeit zur Erweiterung der bekannten aber auch zur Etablierung neuer Techniken.

  • Entwicklung eines günstigen konfokalen Mikroskops aus dem 3D-Drucker: Die Entwicklung eines konfokalen Mikroskops mit Herstellungskosten unter 100 Euro ermöglicht den breiten Einsatz dieser Geräte, zum Beispiel für Ausbildungszwecke oder dient zur Förderung strukturschwacher Regionen.
  • Ramanspektroskopische Bildgebung: Durch Ausnutzung von Raman-gestreuten Signalen wird eine hochfunktionelle Bildgebung realisiert. Diese soll in Zukunft mit anderen Forschungsthemenwie SIM oder Lichtschichtmikroskopie kombiniert werden.
  • Spin Imaging: Mittels Mikrowellenanregung von elektronischen Stickstofffehlstellen in Nanodiamanten und gleichzeitigen Auslesen der Fluoreszenzanregung solcher Fehlstellen können u.a. Magnetfelder - verursacht von Kernspin einzelner Moleküle - aber auch Temperaturen örtlich im Subnanometerbereich aufgelöst werden. Diese Technik etablieren wir zur bildgebenden Einzelmolekülanalytik.
  • Fluoreszenz up-conversion Mikroskopie: Durch spezifische Markierung biologisch relevanter Moleküle mit Nano-Fluoreszenzkonvertern können wir mittels hochlokal erzeugten UV Licht chemische Reaktionen an wenigen Molekülen auslösen, hochlokale, biologische Prozesse in Zellen aktivieren, aber auch die Position dieser Moleküle - ähnlich wie bei der dSTORM Technik - auf der sub-100-Nanometerskala bestimmen.

 Entwicklung neuartiger Algorithmen für die Bildverarbeitung

Insbesondere die hochauflösenden Mikroskopiemethoden benötigen i.A. eine aufwendige nachträgliche Bildverarbeitung.

Daher beschäftigen wir uns zudem mit der Neu- und Weiterentwicklung von theoretischen Ansätzen zur Bildverarbeitung als auch deren praktische Umsetzung:

  • SIM Rekonstruktion: Wir verfolgen verschiedene Ansätze zur Analyse von SIM-Daten:

    • Die schnelle Rekonstruktion von Bildern bei bekannten experimentellen Parametern
    • Die Rekonstruktion ohne exakte Kenntnis ausgewählter experimenteller Parameter (wie etwa der OTF) zulassen.
    • Die Entwicklung von Algorithmen zur Korrektur von Aberrationen durch das Aufnahmesystem oder Bildfehlern durch Bewegungen der Probe. Dadurch sind unsere Systeme vielseitig, insbesondere auch zur Lebendzellbildgebung einsatzbereit.

  • Neuronale Netze: Auf Basis neuronaler Netze entwickeln wir neuartige, optimierte Algorithmen für die Rekonstruktion von mehrdimensionalen Fluoreszenz- und OCT-Daten
  • Parallelisierung: Durch die Parallelisierung unserer Algorithmen mittels Grafikkarten ist eine sehr schnelle Datenauswertung möglich. Dies ermöglicht zum Beispiel eine „On-the-fly“ Rekonstruktion von SIM Daten. Zur Implementierung in MatLab wurde dafür eigens eine Cuda-Bibliothek (CudaMat) entwickelt.

 Hochsensitive Detektion kleinster Verluste in optischen Materialien und Beschichtungen

Zentraler Punkt ist hier der Nachweis von Lichtabsorption bis in den sub-ppm-Bereich in optischen Materialien und Beschichtungen. Realisiert wird dies durch das am IPHT entwickelte und patentierte LID-Verfahren (LID…laser induced deflection) auf Basis des fotothermischen Effektes. Als Herausstellungsmerkmal verfügt das LID-Verfahren als einziges fotothermisches Absorptionsmessverfahren über eine unabhängige absolute Kalibrierung. Die Kombination mit der laserinduzierten Fluoreszenz (LIF) ermöglicht die Bearbeitung einer Vielzahl materialwissenschaftlicher Fragestellungen wie Untersuchungen zu Wechselwirkungsmechanismen von Laserstrahlung mit optischen Materialien sowie dielektrischen, optischen Beschichtungen.

Zur Vermessung der Gesamtheit geringster optischer Verluste wird das Cavity Ring-Down (CRD)-Verfahren eingesetzt. Es ermöglicht u.a. die präzise Bestimmung höchster Spiegelreflektivitäten (R>>99,9%) oder in Kombination mit dem LID-Absorptionsmessverfahren die Aufteilung der optischen Verluste in ihre Bestandteile (Streuung/Absorption).

Eine Vielzahl vorhandener Laserwellenlängen ermöglicht neben der Bearbeitung wissenschaftlicher Fragestellungen auch die Durchführung einer breiten Palette an Dienstleistungen zur Optikcharakterisierung.

Sowohl das LID- als auch das CRD-Verfahren wurde in den letzten Jahren - partiell in Kooperation mit einem externen Partner -  nach dem Leitgedanken „From Ideas To Instruments“ in Produktmuster zur kommerziellen Nutzung überführt.

 

 

 

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