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Spektroskopische Charakterisierung innovativer, licht-aktivierbarer Komplexe für die intrazelluläre Anwendung von Kohlenstoffmonoxid

AM-Konzept für die intrazelluläre Anwendung von CORMs (© Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA).

Versuchsaufbau zur In-vitro-Freisetzung von CO (© Leibniz-IPHT // S. Döring)

a) Auflicht-Bild einer Leber-Sternzelle, sowie die Falschfarben-Bilder der Zelle basierend auf den IR-Daten: b) nach Inkubation mit CORM-Lösung (CORM-Signale in rot, uniform verteilt) sowie c) nach Bestrahlung (keine CORM-, nur Zell-Signale (schwarz) detektierbar) (© Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA).

Von R. Mede //  P. Hoffmann // C. Neumann // H. Görls // M. Schmitt //  J. Popp // U. Neugebauer, // M. Westerhausen

Kohlenstoffmonoxid (CO) ist als hochtoxisches Gas bekannt, es zeigt jedoch in entsprechend geringen Konzentrationen auch eine Vielzahl positiver physiologischer Effekte. Für eine kontrollierte Anwendung von CO direkt in eukaryotischen Zellen muss CO gezielt und sicher zugeführt werden. Dies kann möglicherweise mit Hilfe von CO-freisetzenden Molekülen, sogenannten CORMs (englische Abkürzung für CO-releasing molecules), erreicht werden. Bei CORMs gibt es verschiedene Trigger um das Kohlenmonoxid freizusetzen. Wird die Kohlenmonoxid-Freisetzung z.B. durch Licht ausgelöst, spricht man von PhotoCORMs. Im Rahmen des DFG-Forschungs-Projektes „Häm und Hämabbauprodukte“ wurden durch Projekt-Partner aus dem Institut für Anorganische und Analytische Chemie der Friedrich-Schiller-Universität Jena einige vielversprechende Verbindungen designt und synthetisiert. In der aktuellen Veröffentlichung wurden zwei auf dem Acetoxymethyl(AM)-Konzept basierende PhotoCORMs erforscht. Zur optimalen Aufnahme in die Zelle sind bei diesen PhotoCORMs die Metallcarbonyl-Komplexe lipophiler Natur und mit einer AM-Seitenkette ausgestattet. So können die Komplexe die Zellmembran passieren. Intrazellulär wird die AM-Gruppe durch Esterasen abgespalten und das resultierende, ionische und hydrophilere Produkt bleibt innerhalb der Zelle gefangen (Bild 1).

Um zu überprüfen, ob das innovative Design der neuen PhotoCORMs wirklich zu einer effizienten zellulären Aufnahme führt und ob im Anschluss eine intrazelluläre Freisetzung von CO möglich ist, wurden Zellstudien unter Anwendung bildgebender FT-IR-Spektroskopie durchgeführt. Hierbei konnte für beide CORMs eine merkliche zelluläre Aufnahme nachgewiesen werden, eine uniforme intrazelluläre Verteilung der CORMs visualisiert und anschließend die erfolgreiche In-vitro-Freisetzung von CO zweifelsfrei nachgewiesen werden (Bild 2 & 3). Insbesondere in Hinblick auf eine zeitlich und quantitativ kontrollierte Anwendung von CO muss ebenfalls die maximal freigesetzte Menge an CO pro CORM und die Anzahl an freigesetztem CO pro Zeiteinheit ermittelt werden. Die entsprechenden Kinetiken der CO-Freisetzung wurden dazu als erstes via FT-IR-Spektroskopie bestimmt, indem die Menge an freigesetztem CO in der Gasphase über den CORM-Lösungen während der Bestrahlung mit Licht verschiedener Wellenlängen (365 nm, 405 nm und 470 nm) gemessen wurden. Dabei zeigte sich, dass stets alle drei CO-Liganden der verschiedenen AM-CORMs in die Gasphase abgegeben wurden und somit die eingesetzten PhotoCORMs unter Bestrahlung vollständig zerfielen. Zusätzlich wurden die photo-induzierten Zerfalls-Reaktionen mittels zeitaufgelöster UV-Vis-Spektroskopie direkt in der wässrigen Lösung verfolgt. Hier konnte für beide Methoden übereinstimmend gezeigt werden, dass die Halbwertszeit bei Bestrahlung mit Licht höherer Wellenlänge zunimmt und damit die CO-Freisetzung langsamer verläuft (470 nm << 405 nm < 365 nm). Beim Vergleich beider spektroskopischer Methoden hinsichtlich der Kinetik offenbarte sich, dass sich die Zerfallsgeschwindigkeit am besten direkt am Zerfall des Edukts (UV-Vis-Spektroskopie) ermitteln lässt, da bei der Beobachtung der Produktbildung in der Gasphase über der Reaktionslösung mit Hilfe der FT-IR-Spektroskopie zusätzlich die Diffusionszeit des CO hinzukommt. Der Vorzug der letztgenannten Methode ist die kontaktfreie und direkte Bestimmbarkeit der je CORM freigesetzten CO-Moleküle, auch unter verschiedenen Bedingungen in der Lösung. Des Weiteren ist es unerlässlich, die Identität der verbleibenden Endprodukte zu bestimmen, um mögliche Nebeneffekte dieser Rückstände in der Zelle auszuschließen oder ihr Ausmaß abzuschätzen. Dazu wurden die Produkte aus dem lichtinduzierten Zerfall der CORMS mittels FT-IR-Spektroskopie untersucht. Hierbei zeigte sich, dass unter physiologischen Bedingungen in Phosphat gepufferter Salzlösung das gesundheitlich relativ unbedenkliche Mangan(II)-hydrogenphosphat entsteht.

Im Rahmen der physikochemischen Charakterisierung konnte unter Einsatz leistungsfähiger spektroskopischer Methoden erfolgreich demonstriert werden, dass das hier angewandte innovative AM-Konzept eine äußerst effiziente intrazelluläre Anwendung von PhotoCORMs ermöglicht und damit den Weg für die weiterführende Untersuchung des Effektes der CO-Freisetzung ebnet. Derzeit wird mithilfe von spektrometrischen Methoden an der Quantifizierung der zellulären CORM-Aufnahme und Aufklärung der entsprechenden Aufnahme-Mechanismen geforscht.

Gefördert von: DFG, BMBF

Zugehörige Publikationen

R. Mede, P. Hoffmann, C. Neumann, H. Görls, M. Schmitt, J. Popp, U. Neugebauer, M. Westerhausen: Acetoxymethyl (AM) Concept for Intracellular Administration of Carbon Monoxide with Mn(CO)3-Based photoCORMs. Chemistry – A European Journal 2018, 24 (13), 3321–3329.

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