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Interferenz-verstärkte Raman-Spektroskopie für den Nachweis von Oberflächenfunktionalisierungen

Durch eine Beschichtung mit Aluminiumoxid wird es möglich auf Raman-kompatiblen Chips Biomoleküle sensitiv und zerstörungsfrei nachzuweisen. Dies ist bei der Herstellung von Substraten für die Probenvorbereitung von großer Wichtigkeit, da man so ein Instrument zur Qualitätskontrolle zur Verfügung hat und dementsprechend nur Chips von ausreichender Qualität für weitere Experimente auswählen kann.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Prinzips zur a) Verstärkung bzw. b) Abschwächung der Lichtintensität mittels Interferenz. c) Aufbau der genutzten Chipsubstrate.

Abbildung 2. Raman-Spektren von Ferrioxamin B gemessen mit einer Anregungswellenlänge von 532 nm auf Substraten mit Aluminiumoxid-Beschichtung.

Von A. Pahlow // K. Weber 

Die Raman-Spektroskopie ist ein vielfältiges Instrument für die Charakterisierung von Proben aus verschiedensten Anwendungsfeldern. Die resultierenden Spektren enthalten hochspezifische Informationen über die molekulare Komposition der untersuchten Substanzen. Dies lässt sich unter anderem dafür ausnutzen Bakterien zu identifizieren, was bei der Diagnostik von Infektionskrankheiten ein zentrales Anliegen ist. Zudem können die notwendigen Spektren innerhalb weniger Minuten aufgenommen werden. Daher ist dieser spektroskopische Detektionsansatz überaus attraktiv, da die schnelle Identifizierung der Erreger einen raschen Therapiebeginn ermöglicht, was für schwerkranke Patienten lebensrettend sein kann.

Bei der Untersuchung von medizinischen Proben sind die zu identifizierenden Bakterien allerdings in einer mehr oder weniger komplexen Matrix verborgen, da Körperflüssigkeiten wie Speichel, Urin oder Blut untersucht werden müssen. Um eine erfolgreiche Raman-basierte Detektion der Bakterienzellen vornehmen zu können, müssen diese zuvor aus der Probenmatrix isoliert werden.

Hierzu kann man zum Beispiel biofunktionalisierte Metalloberflächen einsetzen. Metalloberflächen sind deswegen geeignet, da sie kein störendes Hintergrundsignal bei der Raman-Messung der Zellen liefern. Bei der Biofunktionalisierung werden sogenannte Fängermoleküle für die Bakterien auf die Metalloberfläche aufgebracht, damit die in der Probenflüssigkeit befindlichen Bakterien dort haften bleiben. Anschließend werden die entsprechenden Chipsubstrate gewaschen, um unerwünschte Probenbestandteile, die eventuell unspezifisch an die Oberfläche gebunden haben, zu entfernen.

Die Herstellung solcher Chips für die Probenvorbereitung erfolgt in mehreren Schritten und ist ein nicht immer einfach zu kontrollierender Prozess. Zunächst muss die Metalloberfläche mit Hilfe eines Organosilans modifiziert werden, um reaktive Gruppen für die kovalente Bindung von Fängermolekülen zu schaffen. Hierbei nutzt man aus, dass manche Metalle an Luft eine Oxidschicht ausbilden und dann Hydroxygruppen für die Silanisierung zur Verfügung stehen. Anschließend können Fängermoleküle für Bakterien, zum Beispiel Antikörper oder Siderophore stabil auf der Metalloberfläche verankert werden. Sowohl der Nachweis der chemischen Funktionalisierung mit einem Silan, als auch der Nachweis der biologischen Funktionalisierung mit einem Fängermolekül, ist gewöhnlich aufwendig oder resultiert in der Zerstörung des untersuchten Substrates. Dies war für uns Motivation eine alternative Methode zu entwickeln.

Unsere bisher genutzten und bewährten Raman-Chipsubstrate werden ausgehend von Siliziumwafern hergestellt, auf welche Messfelder aus Aluminium mittels Kathodenzerstäubung aufgebracht werden. Um die nachfolgend angestrebten Modifizierungen mittels Raman-Spektroskopie nachzuweisen, haben wir eine zusätzliche Beschichtung der Chips mit Aluminiumoxid durchgeführt. Dabei ist es wichtig, dass die Aluminiumoxidschicht eine ganz

bestimmte Dicke aufweist, deren konkreter Wert von der Anregungswellenlänge abhängt, die bei der späteren Raman-spektroskopischen Untersuchung verwendet wird. Je nach Schichtdicke kommt es bei der Einstrahlung von monochromatischem Licht zu einer Verstärkung oder Abschwächung des Signals. Das dahinterliegende physikalische Prinzip ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt. Trifft das Laserlicht auf die Aluminiumoxidschicht, wird ein Teil reflektiert, während der andere Teil gebrochen wird und die Schicht passiert bis er auf den Aluminiumspiegel trifft und dort reflektiert wird. Beim Austritt aus der Aluminiumoxidschicht überlagern sich dann beide Teile, was man als Interferenz bezeichnet. Je nach Gangunterschied (d.h. der Differenz der zurückgelegten Strecke), kommt es entweder zu einer Abschwächung oder Verstärkung der Amplitude. Auf diese Weise kann man auch das Raman-Signal von Molekülen, die unmittelbar auf der Aluminiumoxidschicht verankert sind, verstärken oder abschwächen. Wir konnten dies unter anderem erfolgreich für das Siderophor Ferrioxamin B zeigen, welches ein vielversprechender Kandidat für die Isolation verschiedener pathogener Bakterien ist. In Abbildung 2 sind Spektren des Siderophors gemessen auf Substraten mit unterschiedlich dicken Aluminiumoxidschichten sowie wie einem unbeschichteten Aluminiumchip dargestellt. Da wir die Messungen mit einer Anregungswellenlänge von 532 nm durchgeführt haben, führen Schichtdicken von 75 nm zu einer Verstärkung, während 150 nm Aluminiumoxid das Signal nahezu auslöschen. Eine Schichtdicke von 112 nm wirkt sich nur geringfügig verstärkend auf die Raman-Signalintensität aus.

Mit diesen Ergebnissen ist es uns gelungen, die Interferenz-verstärkte Raman-Spektroskopie erstmals für den Nachweis von Biomolekülen einzusetzen. Die neuartigen Chipsubstrate ermöglichen uns vor ihrer Anwendung in Isolierungsexperimenten für Bakterien zu überprüfen, ob die Funktionalisierung mit den Fängermolekülen tatsächlich erfolgreich war. Für diese Qualitätskontrolle kann das gleiche Spektrometer wie für die Untersuchung der Bakterien verwendet werden, so dass keine zusätzlichen Kosten für die Anschaffung eines weiteren Messgerätes entstehen.

Gefördert von: BMBF

Zugehörige Publikationen

Pahlow, S.; Mayerhöfer, T.;  van der Loh, M.; Hübner, U.; Dellith, J.; Weber, K.; Popp, J. 2018, Anal. Chem. Interference Enhanced Raman Spectroscopy as a Promising Tool for the Detection of Biomolecules on Raman-compatible Surfaces, 90, 9025-9032.

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